DIAGNOSTICO PREMORTEM DE LA ENFERMEDAD DE CREUTZFELDT-JAKOB. TEST DE LA PROTEINA 14-3-3 EN LCR.

Cuadrado Corrales N, Gonzalo Pascual I.*

Grupo de Vigilancia de la Enfermedad de Creutzfelt-Jakob. Centro Nacional de Epidemiología. Instituto de Salud "Carlos III". Madrid.
*Banco de Tejidos para Investigación Neurológica. Facultad de Medicina. Universidad Complutense. Madrid.

Correspondencia
Natividad Cuadrado Corrales.
Banco de Tejidos para Investigación Neurológica.
Facultad de Medicina. Universidad Complutense.
28048. Madrid. España.
Tel. 91 394 1326. Fax. 91 394 1329.
E-mail. n.cuadrado@lettera.net.

Resumen

Fundamento. El estudio de las proteínas 14-3-3 en líquido cefalorraquídeo ( LCR ) muestra alta sensibilidad y especificidad en el diagnóstico premortem de la Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob ( ECJ ).

Métodos. Mediante la técnica de detección de proteina 14-3-3 en LCR se estudiaron 98 LCR de supuestos ECJ y 62 LCR de controles con diferentes diagnósticos neurológicos y controles sanos. Para el análisis de resultados se incluyeron 49 pacientes que cumplen criterios clínicos de definición de ECJ.

Resultados. La técnica en estudio detectó la proteína 14-3-3 en LCR de 46 pacientes con ECJ. Entre los controles resultaron positivos 4 LCR.

La eficacia o valor global del test fue de un 93,69 %; el valor predictivo positivo fue del 92 %; el valor predictivo negativo fue del 95,08 %. La sensibilidad del test en nuestra cohorte fue de un 93,87 % si se consideran los ECJ familiares, y aumentó hasta un 98 % si no incluimos los ECJ con etiología genética.

Conclusiones. La detección de proteína 14-3-3 en LCR se perfila como un marcador característico y altamente indicativo, aunque no específico, para ECJ; esto debe interpretarse dentro del contexto de diagnóstico clínico diferencial.

Palabras claves. Enfermedad de Creutzfelt-Jakob, prión, líquido cefalorraquídeo, proteína 14-3-3.

Introduccion

La presencia de proteína 14-3-3 en LCR y la detección de la proteína priónica infectiva (PrP ^sc) en biopsias cerebral y de tejido linfoide( amígdala ) han sido descritas como marcadores para el diagnóstico "premortem" en la ECJ .

ECJ, Gerstmann.Sträussler-Scheinker (GSS) e Insomnio Familiar Fatal (IFF) pertenecen al grupo de encefalopatías espongiformes transmisibles (EET) en humanos, al igual que el "scrapie" en ganado ovino y encefalopatía espongiforme bovina ( EEB ) en bovino. El diagnóstico definitivo de EET requiere un estudio histológico del tejido cerebral o estudio genético en los casos familiares. Un diagnóstico con grado de certeza de "probable" requiere además de una demencia rápidamente progresiva un electroencefalograma ( EEG ) típico con complejos lentos y periódicos. EEG típico se ha descrito en un 60% de los ECJ esporádicos (2) y está ausente en ECJ nueva variante y ECJ iatrogénicos por hormona de crecimiento. La carencia de un EEG típico parece estar asociado con una clínica de larga duración y con la etiología de la enfermedad. Además este EEG típico no es específico de ECJ, puede aparecer en casos de intoxicación con litio, antidepresivos tricíclicos, fenilciclidina, en encepalopatías metabólicas y anóxicas y en encefalopatías víricas.

El objetivo de este trabajo ha sido la descripción de los valores predictivos de la detección de la proteina 14-3-3 en LCR para el diagnóstico clínico de la ECJ.

Materiales y métodos

Pacientes.

El análisis de la proteina 14-3-3 se realizó en 98 LCR con sospecha de ECJ remitidos al Banco de Tejidos para Investigación Neurológica desde Enero de 1997 hasta Agosto de 1998, y en 57 controles con diferentes diagnósticos clínicos procedentes del Servicio de Neurología del Hospital General de Segovia y de nuestra seroteca.

En el análisis de resultados solamente se incluyeron los pacientes que cumplen criterios de definición de la ECJ ( tabla 1 ).

Inmunotinción

La detección de proteina 14-3-3 en LCR se hizo siguiendo la técnica descrita por Hsich et al¹ con modificación de alguna variable. Las proteínas de 40 ml se solubilizaron a100ºC en presencia de SDS, 2-mercaptoetanol fue añadido para reducir los puentes disulfuro. Las proteínas fueron separadas mediante electroforesis en un gel desnaturalizante (SDS-PAGE 12%,5%) a corriente constante y posterior transferencia a una membrana de nitrocelulosa (0,2mm). La inmunotinción comienza bloqueando con gelatina disuelta en buffer salino ( TBS ) durante 2 horas, seguido por incubación con anticuerpo policlonal anti-14-3-3 (SantaCruz Biotecnology,nº Sc-629. ) a una dilucción 1:500 seguido de una incubación con anticuerpo secundario IgG alcalina fosfatasa (Pierce, nº 31340.) a una dilucción 1:5000. El antígeno fue detectado mediante reacción colorimétrica.

Resultados

Pacientes.

Los resultados de la detección de la proteína 14-3-3 en LCR se reflejan en la tabla 2. De los 49 ECJ en estudio, el 22,45 % eran definitivos, el 44,89 % eran probables y el 32,65 % era posibles.

Tres casos EET familiares( 6%), todos ellos con mutación ( D178N )en el codón 178 del gen que codifica para la proteína priónica (PRPN). Dos casos tienen diagnóstico definitivo de ECJ y el tercero con diagnóstico de IFF.

Los dos ECJ familiares fueron remitidos al Banco de Tejidos para Investigación neurológica como "posibles" ECJ, ninguno presentaba EEG típico, e incluso en uno de ellos una biopsia cerebral había resultado negativa para ECJ; estudios genéticos realizados en nuestro laboratorio revelaron el carácter familiar definitivo en los dos casos.

El 94% eran ECJ esporádicos, el 32,65% de estos no presentaban EEG típico ( 67,35% presentaban EEG típico ).

Sensibilidad, valores predictivos del test de la proteína 14-3-3.

La proteína 14-3-3 fue detectada en 46 de los 49 LCR; de los tres falsos negativos, dos corresponden a ECJ familiares y el tercero a un ECJ esporádico. El valor de la sensibilidad en nuestra cohorte fue del 93,87 % si se consideran los casos familiares, y aumenta hasta un 98 % si no incluimos estos casos.

La proteína 14-3-3 resultó positiva en LCR de 4 pacientes con distinta clínica neurológica ( enfermedad de Parkinson, encefalopatía mitocondrial, encefalitis de Hashimoto, hidrocefalia ) y negativa en 58 LCR de pacientes con diferentes clínicas neurológicas y controles sanos. El valor predictivo positivo para la detección de la proteina 14-3-3 en LCR en ECJ esporádicos fue 92%; el valor predictivo negativo en los casos estudiados con clínica neurológica distinta de ECJ fue 95,08 %.

La eficacia o valor global del test en estudio fue 93,69 %.

Discusión

Los valores predictivos de un test son variables. Dependen de la prevalencia de la enfermedad en la población. ECJ tiene una proporción de casos en la población muy baja, un caso por millón de habitantes y por año, incluso un test muy específico dará lugar a muchos falsos positivos.

En el test de la detección de la proteína 14-3-3 en LCR los falsos positivos que aparecen ( esclerosis múltiple, infarto cerebral agudo, encefalitis viral..) (1,2) se diferencian claramente por su clínica de ECJ; sin embargo los diagnósticos que se prodrían solapar clínicamente con ECJ ( enf. Alzheimer, otras demencias ) son verdaderos negativos.

El hecho de que aparezcan tantos falsos positivos, aunque clínicamente no creen controversia diagnóstica, hace aconsejable realizar la determinación de la proteína 14-3-3 en un contexto clínico apropiado.

El valor predictivo negativo ( proporción de resultados válidos entre el conjunto de resultados negativos ) es de un 95,8 % en nuestro estudio; este valor aumenta hasta un 98,30 % si excluimos los ECJ familiares. Esto mismo ocurre entre los datos de sensibilidad difieren, entre un 93,87 % y un 98 % . Un diagnóstico "premortem" de encefalopatías espongiformes transmisibles debe tener una combinación de estudios bioquímicos y moleculares.

El valor predictivo positivo ( proporción de resultados válidos entre los resultados positivos ) es de un 92 %, valor inferior al resto de valores predictivos debido a la baja prevalencia de la enfermedad en la población; sin embargo los falsos positivos que aparecen no cumplen criterios clínicos de "posible" ECJ.

La detección de la proteína 14-3-3 en LCR es un test altamente sensitivo para apoyar el diagnóstico de ECJ (3). Este test predice el diagnóstico de ECJ más específicamente que otros test clínicos , dando información en los ECJ "posible" donde no aparece el EEG típico y reforzando el diagnóstico clínico en los ECJ "probables" o ayudándo a diferenciarlos de posibles demencias provocadas por intoxicación donde también aparece el EEG típico. El test en estudio es más sensitivo que el EEG, para apoyar el diagnóstico clínico de ECJ , y debería ser incluido como criterio en el diagnóstico clínico de ECJ (2).

Las proteínas 14-3-3 son unas pequeñas ( 30Kd ), citosólicas y evolutivamente conservadas proteínas en el sistema nervioso (4). Existen como dímeros (5), unidas a otras proteínas neuronales ( PKC, Raf y Kinasas) que juegan un papel muy importante en la transmisión neuronal. Mutaciones en el gen que codifica para la proteina 14-3-3 en Drosophila revelan un papel de difenrenciación y plasticidad neuronal de esta familia de proteínas (6). Se desconoce porqué la detección de las proteínas 14-3-3 en LCR es un marcador específico de ECJ dentro de las demencias. Aunque estas proteínas se expresan en distintas regiones del sistema nervioso ( neocortex, tálamo, bulbo olfatorio, cerebelum), Watanabe el al ^7,8 muestran su máxima concentración en el hipocampo, por lo que sugerimos que el grado de pérdida neuronal y lesiones en el hipocampo está altamente relacionado con la concentración de proteína 14-3-3 en LCR.

Las proteínas 14-3-3 son componentes de los "ovillos neurofibrilares" (8) que se forman en el hipocampo de diferentes enfermedades neurológicas (E. Alzheimer, E.Pick, GGS..); aunque en estas enfermedades aparezcan lesiones y pérdida neuronal en el hipocampo, parte de las proteinas 14-3-3 se incorporan a la estructura de los "ovillos neurofibrilares" , disminuyendo considerablemente la concentración de estas proteínas en la LCR, es por ello por lo que no pueden ser detectadas por el test objetivo del presente estudio.

El hecho de que pacientes con la mutación D178N, sin diferencia en la duración de la enfermedad, tengan diferentes resultados ( falsos negativos, verdaderos positivos) en el test de la proteina 14-3-3 en LCR, sugiere que la acumulación de estas proteínas en LCR no es debido a la rápida progresión de la enfermedad, sino mas bien a la diferente localización de las lesiones producidas y al grado de pérdida neuronal.

A pesar de que los valores predictivos y datos de sensibilidad del test de la proteina 14-3-3 son elevados, creemos necesario, en la actualidad, llegar hasta el diagnóstico definitivo de ECJ, mediante estudios moleculares y neuropatológicos.

Agradecimientos.

A los organizadores del "Congreso Virtual de Neurología" por darnos la oportunidad de hacer público nuestro trabajo. A todos los especialistas que nos han remitido LCR de sus pacientes porque sin ellos no habría sido posible realizar este estudio. Al Dr. C. Tabernero del Servicio de Neurología del Hospital General de Segovia por habernos cedido LCR controles. Al Dr. J. García de Yébenes Director del Banco de Tejidos para Investigación Neurológica.

 

Tabla 1. Criterios de definición de la Enfermedad de Creutzfedlt-Jakob Esporádico

Esporádicos

• Definitivo:
  • a- confirmación neuropatológica
  • b- confirmación inmunocitoquímica
  • c- confirmación genética
• Probable:
  • Demencia rápidamente rogresiva
  • EEG típico
  • Dos o más de los siguientes criterios clínicos
    • 1-Mioclonías
    • 2-Ateraciones visuales o cerebelosas
    • 3-Signos piramidales/extrapiramidales
    • 4-Mutismo acinético.
• Posible:
  • Tres o cuatro de los criterios clínicos anteriores.
  • EEG atípico o no existente.
  • Duración de menos de dos años.

Tabla 2. Detección de la proteina 14-3-3.