TECNICAS DE INMUNOHISTOQUIMICA EN LAS ENFERMEDADES POR PRIONES

Gonzalo Pascual I, Cuadrado Corrales N.*

Banco de Tejidos para Investigación Neurológica. Facultad de Medicina. Universidad Complutense de Madrid.
*Grupo de Vigilancia de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob. Centro Nacional de Epidemiología. Instituto de Salud Carlos III. Madrid.

Correspondencia:
Dra. Isabel Gonzalo
Banco de Tejidos para Investigación Neurológica.
Facultad de Medicina. Universidad Complutense de Madrid.
28040 Madrid. Tel: 91 394 13 26/ Fax: 91 394 13 29
E-mail igonzalo@lettera.net.

 

RESUMEN

Las enfermedades por priones se caracterizan por presentar un amplio espectro de fenotipos con diferentes presentaciones clínicas y neuropatológicas. La detección de la proteína priónica (PrP) es un marcador empleado como herramienta para realizar el diagnóstico definitivo de estas enfermedades neurodegenerativas. Su presencia se puede observar mediante técnicas de inmunohistoquímica y bioquímicas. A nivel inmunohistoquímico la PrP presenta principalmente tres tipos de patrones de tinción: en forma de placas de amiloide-PrP, perivacuolar y difuso-sináptico.

PALABRAS CLAVE: proteína priónica, inmunohistoquímica, enfermedades por priones.

 

Bajo el término de encefalopatías espongiformes transmisibles (EET) o enfermedades por priones, se engloban un grupo de enfermedades, caracterizados por la presencia en el cerebro de una isoforma infectiva (PrPSc o PrPCJD) de una proteína normal denominada proteína priónica (PrPc).

En la actualidad, el diagnóstico premortem de las enfermedades por priones se realiza mediante diagnóstico clínico y la detección de la proteína 14-3-3 en líquído cefalorraquídeo dando lugar a un diagnóstico de "probable", mientras que para obtener un diagnóstico de "definitivo", es necesario que se cumplan al menos dos de los siguientes criterios "transmisión a animales, presencia de PrP, o mutaciones en el gen que codifica para la proteína priónica" siendo necesario la confirmación histológica para pasar de "probable" a "definitivo"; por lo cual es recomendable realizar la necropsia en aquellos casos de sospecha de enfermedades por priones.

La detección de la PrPCJD es hoy el marcador diagnóstico más fiable de las enfermedades por priones. Puede ser detectada mediante técnicas de Western blot, histoblot, microscopía electrónica, pero tienen el inconveniente de que requieren material fresco lo cual disminuye su uso debido a la capacidad infectiva de la proteína priónica. Otra posibilidad es la detección mediante técnicas de inmunohistoquímica realizadas sobre material fijado en formol e incluído en parafina, al que se ha realizado un paso previo por ácido fórmico (1) para anular la infectividad.

 

ASPECTOS TECNICOS

Las técnicas de inmunohistoquímica (IHQ), se basan en la reacción antígeno-anticuerpo (Ag-Ac), y consisten en incubar el Ag que queremos detectar, (en este caso la PrPCJD ), frente a un Ac (anti-PrPCJD); y mediante un sistema de amplificación junto con el empleo de un sistema revelador; esta unión pueda ser visualizada al microscopio óptico.

En este proceso hay que tener en cuenta dos aspectos: "tipo de Ac y pretratamiento empleados", pudiendo dar lugar a resultados diferentes tanto en tipo como en intensidad de tinción. Hay una gran variedad de Ac (Tabla. 1) obtenidos principalmente de dos formas; frente a los llamados "prion rods o fibrils scrapie" y a fragmentos de péptidos sintéticos de la proteína priónica (2-5); y aunque reconocen ambas isoformas de la proteína (normal y alterada), se han llevado a cabo numerosos estudios con controles negativos en los que no se ha detectado positividad para la proteína; además parece ser que la PrPc es una proteína frágil que puede ser preservada sólo con procedimientos especiales de inclusión, mientras que la PrPCJD parece ser más resistente a la fijación en formol e inclusión en parafina; y aunque los mecanismos moleculares de los sistemas de recuperación antigénica no son bien conocidos, parece ser que éstos pretratamientos, destruyen la PrPc con lo que no interferiría en la detección de la PrPCJD(6,7). Aunque recientemente se ha desarrollado un Ac que sólo reconoce la isoforma alterada (8).

La función principal de los sistemas de recuperación antigénica, es el desenmascaramiento del Ag (producido por los fijadores, como el formol, mediante enlaces tipo aldehído). Debido a la existencia de varios tipos de pretratamientos (Tabla. 2), el resultado final puede ser variable de un laboratorio a otro aunque se están intentando unificar criterios y protocolos para que las positividades obtenidas sean lo más homogéneos posibles y puedan ser comparados (9-11).

La IHQ es un gran soporte para realizar el diagnóstico diferencial, debido a que el aspecto espongiforme no es específico de las enfermedades por priones, ya que puede estar presente en otras enfermedades neurodegenetivas como son la enfermedad de Alzheimer (EA), la enfermedad de Pick´s, la enfermedad de Huntington, demencias del lóbulo frontal, encefalopatías metabólicas, la enfermedad difusa por cuerpos de Lewy, edemas cerebrales y por posibles artefactos del tejido; e incluso se han descrito casos en los que pueden coexistir la EA y la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob sobre todo en aquellos casos de edad más avanzada (12-17).

 

TIPOS DE PATRON DE TINCION DE LA PrP

La topografía que la PrP muestra en las enfermedades por priones es muy amplia y hetereogénea, encontrándose en ocasiones de forma focalizada, con lo que para evitar un posible error en el diagnóstico, es recomendable realizar un exhaustivo estudio que comprenda un amplio número de zonas del cerebro como son : corteza cerebral (frontal, temporal, parietal y occipital), ganglios basales, tálamo, hipotálamo, cerebelo e hipocampo. Además la distribución de la PrP en el sistema nervios central no está restringida a la sustancia gris, sino que puede detectarse en zonas donde el aspecto espongiforme está ausente como es en la médula espinal (18). También ha sido detectada en otras localizaciones extracerebrales (tejido linfoide, etc) (19-21).

La proteína priónica, muestra principalmente tres tipos de patrón de tinción: a) en forma de placas de amiloide-PrP, b) perivacuolar y c) difuso-sináptico.

a) Patrón de placas de amiloide-PrP; (Figura 1) globalmente los sitios más frecuentes de localización de las placas (aunque su proporción varían según el tipo de enfermedad) son en el cerebelo concretamente en la capa granular, pudiendo ser detectadas en la capa molecular y en la sustancia blanca central aunque en menor proporción; mientras que las células de Purkinje son negativas. También se pueden detectar en ganglios basales, tálamo y corteza cerebal. La morfología de estas placas puede ser de las bien definidas placas tipo "Kuru", "floridas", en forma de depósitos grandes, confluentes de aspecto más irregular denominadas "multi o unicéntricas" (22-24).

b)Patrón perivacuolar, (Figura. 2) consite en depósitos de PrP que se manifiestan en aquellos casos con un severo aspecto espongiforme, localizándose entre las vacuolas confluyentes y en la periferia de estas lesiones; mientras que si el tamaño de las vacuolas es pequeño (microcísticas), la expresión de la PrP puede ser negativa aunque se empleen los pretratamientos más enérgicos (22-24).

c)Patrón difuso-sináptico, (Figura. 3a y b) consiste en una tinción granular de la sustancia gris que por su parecido con la tinción obtenida con anticuerpos anti-sinaptofisina, ha aquirido este nombre. En la corteza cerebelar se ven depósitos en la capa granular, su localización y tamaño sugieren que son componentes de los glomérulos del cerebelo. También se ha detectado positividad de PrP a lo largo de fibras o tractos (Figura. 4), en neuronas, intra y perineuronal, en forma de depósitos granulares (Figura.5) así como en el citoplasma de astrocitos (23-27).

 

EXPRESIÓN DE PrP EN LAS ENFERMEDADES POR PRIONES

Las enfermedades por priones se clasifican en: enfermedad de Kuru, Gerstmann-Sträusler-Scheinker (GSS), el Insomnio Familiar Fatal (IFF) y la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ), que dependiendo de su etiología puede ser esporádica, familiar, iatrogénica y la reciente nueva variante. La expresión a nivel inmunohistoquímico de la PrP es muy variable y hetereogénea, ya que está influenciada por varios factores que consideraremos más adelante; pero si vamos desglosando grupo por grupo la expresión de PrP que se observa es:

Enfermedad de Kuru

Aproximadamente el 70% de los casos expresa placas de amiloide PrP de tipo Kuru cuya morfología es la de un núcleo compacto del que emergen fibrillas radiales presentando un halo claro alrededor; localizadas en el cerebelo, principalmente en la capa granular aunque también se detectan entre las células de Purkinje y en la capa molecular (17,23,24,28-30).

Enfermedad de Gerstmann-Sträusler-Scheinker

El tipo de placa más característica es la denominada multicéntrica, consiste en una gran masa de amiloide-PrP rodeada de pequeños depósitos amiloides; ésta es muy numerosa en el cerebelo tanto en la capa granular como en la molecular, debido a que el cerebelo suele estar severamente afectado; aunque también puede estar presente en la sustancia blanca cerebelar, corteza cerebral y ganglios basales, con una localización de las lesiones variable, dependiendo de la mutación que exprese el individuo(17,23,24,31-33).

Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob

Los casos de ECJ se caracterizan por presentar un amplio espectro de fenotipos de PrP debido a las diferentes subcategorías clinico-neuropatológicas establecidas(34,35). Hay que tener en cuenta que las placas de amiloide-PrP sólo se detectectan en el 5 a 10% de los casos de ECJ esporádicos, siendo este porcentaje más elevado en los casos familiares; mostrando los otros tipos de expresión de PrP comentados anteriormente (perivacuolar y difuso-sináptico). Cuando se observan placas éstas son de tipo Kuru localizadas preferentemente en la capa granular del cerebelo, y ocasionalmente en la corteza cerebral, ganglios basales y tálamo (17,23,24,36-41).

Los casos iatrogénicos pueden ser divididos en dos grupos según la vía de infección; si ésta es periférica (por administración de hormonas crecrecimiento o derivados de hormonas pituitarias...), suele estar implicado el cerebelo predominantemente con una expresión de la PrP de forma difusa más que en forma de placa sobre todo en la capa granular (23,24,42,43). El cambio espongiforme y la positividad para PrP puede estar muy limitada en los casos iatrogénicos. Mientras que los casos infectados de forma central (por procedimientos quirúrjicos, transplantes de córnea, duramadre, implantes de electrodos...) presentan una expresión más similar a los ECJ esporádicos (17,44).

En lo que respecta a la nueva variante, se caracteriza por la presencia de placas floridas, en una elevada proporción, formadas por un denso núcleo y rodeadas de un halo de espongiosis. También se observan placas de menor tamaño y depósitos de PrP en la corteza cerebral y en el cerebelo tanto en la capa molecular como en la granular, y en menor proporción en el tálamo, ganglios basales e hipotálamo(45).

Insomnio Familiar Fatal

El tálamo es la zona principalmente afectada con una severa gliosis y ausencia de aspecto espongiforme. No se ha detectado expresión de PrP a nivel inmunohistoquímico, debido a que se encuentra en baja concentración, aunque la PrP puede ser detectada mediante técnicas bioquímicas (46-49).

 

FACTORES QUE INFLUYEN EN LA EXPRESION DE PrP

El estudio de aquellos casos en los que se sospecha la existencia de enfermedad por priones, debe ser realizado en conjunto teniendo en cuenta muchos factores que pueden influir en la expresión de la PrP como son: la evolución clínica o duración de la enfermedad, ya que en aquellos casos de un mayor curso clínico expresan un mayor número de placas(26,50), el grado de espongiosis, ya que los depósitos de PrP se localizan en zonas donde las vacuolas son grandes y confluyentes y no en las vacuolas pequeñas o microcísticas(23) así mismo la presencia de espongiosis no siempre se relaciona con la expresión de PrP, hay casos donde la PrP se ha detectado en zonas que no presentaba espongiosis(51), el posible papel que pueda desempeñar la microglia como mediador de la degeneración neuronal y muerte celular en las enfermedades por priones (52-54); así como el polimorfismos del codon 129 del gen de la proteína priónica, ya que parece ser que la homocigosidad predispone a desarrollar la enfermedad, sobretodo en los casos esporádicos e iatrogénicos(55-58), y el tipo de patrón de glicosilación de la proteína priónica está relacionada con los diferentes fenotipos de las enfermedades por priones(59).

Las enfermedades por priones se caracterizan por mostrar una gran variedad fenotípica, debiendo ser consideradas en cada caso todas las variables (clínicas,genética, inmunohistoquímica) que influyen en el mismo.

 

 

Tabla. 1. Diversidad de Anticuerpos anti-PrP(23)

Anticuerpo Antígeno Fuente
ME7 Scrapie fibrillas Dr. J. Hope (Edinburgo)
IB4 "  
IB3 "  
IA8 "  
RO73 Hamster prion Dr. S. Prusiner(California)
611 "  
1755 Péptido sintético Dr. H. Diringer(Berlin)
SP30 Péptido sintético Prof.B. Anderton(London)
SP40 "  
3F4 Péptido sintético Dr. Kascsak(New York)
PrP Nott Péptido sintético Prof. R.J. Mayer
KG9 PrP bovina recombinante Dr. C. Birket(crompton)

 

 

Tabla. 2. Tipos de pretratamientos(9,1017,23)

  • 80-11% ácido fórmico durante 5-60 min.
  • 4M thiocyanato de guanidina (TG) 2h
  • proteinasa K 10 ug/ml, 15 min., 37ºC
  • pepsina 10%, 30 min., 37ºC
  • autoclave hidrolítica, 2. 5mM HCl, 10 min., 121ºC
  • autoclave hidratada, agua destilada, 10 min. 120ºC
  • 30% ácido fórmico, 1 mim microondas
  • 96% ácido fórmico, 60 min., 4M (TG), 2h
  • combinaciones entre ellos.......

 

(Pendiente de remitir al Congreso)

Figura 1
ECJ. Positividad para PrP en forma de placa de amiloide-PrP en la corteza frontal (X40. ABC)

 

(Pendiente de remitir al Congreso)

Figura 2
ECJ. Depósitos de PrP localizados en un área con severo aspecto espngiforme en la corteza frontal (X40.ABC)

 

(Pendiente de remitir al Congreso)

Figura 3a y 3b
ECJ. Positividad para PrP con un patrón de tinción granular difuso en la capa granular del cerebelo (X20, X40. ABC)

 

(Pendiente de remitir al Congreso)

Figura 4
ECJ. Expresión de PrP en tractos de fibras nerviosas en corteza occipital (X40. ABC)

 

(Pendiente de remitir al Congreso)

Figura 5
ECJ. Positividad para PrP perineuronal en corteza frontal (X40. ABC)

 

 

AGRADECIMIENTOS

A los organizadores del "Congreso Virtual de Neurología Iberoamericana". Al Grupo de Vigilancia de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob. (Centro Nacional de Epidemiología, Instituto de Salud Carlos III). A los Servicios de Anatomía Patológica de los Hospitales Marqués de Valdecilla (Santander), Ntra. Sra. De la Candelaria (Sta. Cruz de Tenerife), 12 de Octubre (Madrid), Clínico Universitario (Valencia); al Servicio de Neurología del Hospital Gregorio Marañón (Madrid). Al Dr. García de Yébenes, Director del Banco de Tejidos para Investigación Neurológica.

 

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