LOS PRIONES Y SU BIOLOGÍA
María Gasset* y Dave Westaway**
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Los priones son los agentes causantes de un grupo de patologías neurodegenerativas letales características de mamíferos, también conocidas como encefalopatías espongiformes transmisibles. Estos agentes son capaces de propagarse dentro de un mismo huesped causando una lesión espongiótica y de transmitirse de huesped a huesped con elevados tiempos de incubación. A diferencia de virus y viroides, son resistentes a tratamientos inactivantes de ácidos nucléicos, pero comparten con éstos la existencia de una variabilidad de inóculos dentro de la misma especie (diferenciables por el patrón de la lesión y la magnitud del tiempo de incubación) y de una infectividad sujeta a barrera de especie (Chandler, 1961; Alper y cols., 1967; Hunter, 1972; Prusiner, 1982; Bruce y Fraser, 1991; Bessen y Marsh, 1992).
La búsqueda de la entidad molecular constitutiva de este agente reveló como componente mayoritario, si no único, una proteína: PrPSc, proteína del prion de scrapie),y la ausencia de un ácido nucleico específico (Prusiner 1982, 1991). Con estas premisas estructurales unidas a la capacidad de infección, Prusiner acuña el término prion (particula infecciosa de naturaleza proteica) para diferenciarlo de virus y viroides. Dadas las características poco convencionales de los priones se han elaborado numerosas hipótesis sobre su estructura (Dickinson y Outram, 1988; Prusiner, 1991; Weissmann, 1991). En la actualidad la hipótesis con mayor grado de aceptación es la conocida como "sólo proteína", delineada inicialmente por Griffith (1967) y, formalmente enunciada y actualizada por Prusiner (1991, 1997). Tras la descripción de proteínas de diferente secuencia pero similar comportamiento en levadura así como los avances interdisciplinares realizados en el conocimento de estos agentes en la última década, el concepto de prion ha sido acotado adquiriendo una defición más precisa y generalizable (Wicker y Masison, 1996; Lindquist S., 1997; Prusiner, 1997). Así, se denomina prion a la forma alterada de una proteína celular funcional (PrP en mamíferos) que ha podido perder su función normal pero que ha adquirido la capacidad de transformar la forma normal en patológica.
La estructura y la expresión del gen de PrP.
La proteína del prion, identificada originalmente en roedores infectados con scrapie, está codificada por un gen cromosómico de copia única (Chesebro y cols., 1985; Oesch y cols., 1985). Este gen se encuentra áltamente conservado y se ha identificado en más de 13 especies de mamíferos. Generalmente está compuesto por dos exones no traducidos en 5´ separados por un intron de ~2 kb, que tras splicing quedan unidos al exon 3 que contiene la region codificante (750 bp). El codon de iniciación se localiza a 10 nucleotidos 3´ del sitio aceptor de splicing lo que imposibilita la interrupción del mensaje y la existencia de formas alternativas. Experimentos de clonaje han permitido obtener todo un conjunto de mutaciones ligadas a patologías hereditarias, perfilar posiciones polimórficas y describir una rica variedad de mutaciones sin sentido en distintas especies (Prusiner, 1997; Lee y cols., 1998).
La incertidumbre reinante sobre PrP y su maleabilidad conformacional dictó la búsqueda de genes vinculados y elementos reguladores que pudieran desempeñar un papel activo. Así, las 145 kb del DNA de los genes humano y ovino de PrP y dos alelos de Prn-p se analizaron en detalle en búsqueda de regiones conservadas, ORFs, exones potenciales, sequencias repetitrvas, posibles islas CpG y motivos polimórficos. Hasta la fecha no ha sido posible identificar ningún gen relacionado (por ejemplo de carabinas moleculares, etc) en la proximidad pero si se han observado algunas características no esperadas dentro de los genes salvajes de PrP. En este sentido, el alelo predominante del gen de ratón, Prn-pa, encontrado en 44 cepas de laboratorio contiene 6878 nucleotidos de un genoma retroviral insertado en la cadena complementaria del intron 2. Este elemento IAP está flanqueado por duplicaciones del motivo AAGCTT encontrado en el gen Prn-pb y áltamente relacionado con el transposón prototipo IAP prototipo y diferenciándose principalmente en una pequeña deleción del gen de la polimerasa. Estos datos indican un origen transposicional reciente. En el caso del gen de oveja, la región no traducida 3´(UTR), particularmente larga, refleja mayoritariamente la presencia de un trasposón fosil de tipo "mariner" de 1.2 kb, ausente en los genes de ratón y humano. La inestabilidad cromosómica asociada a la presencia de elementos de tipo "mariner" en el cromosoma 17 humano sugiere que las posiciones adyacentes al gen ovino de PrP y, por similitud, en el bovino son competentes para reorganizaciones de DNA. Por último el intron grande del gen humano contiene una sequencia análoga al exon 2 de los genes de raton y de oveja, flanqueados por sitios consenso aceptores y donantes de splicing, si bien queda por establecer hasta que punto las secuencias tipo exon 2 están incluidas en algun subconjunto de los mRNAs de la PrP humana. Estos datos indican que la organización base del gen ancestral de PrP, previo a la especiación de mamíferos, fuese de 3 exones.
Con respecto a la expresión del gen de PrP ésta ocurre constitutivamente en tejidos neuronales y no neuronales de animales adultos, detectándose los niveles más altos en neuronas (Kretzschmar y cols., 1986). En cerebros animales, la síntesis de mRNA de PrP ocurre constitutivamente en estados adultos, pero durante el desarrollo se encuentra bajo un control riguroso (Chesebro y cols., 1985; Oesch y cols., 1985). En el septum, los niveles de los mRNA de PrP y de acetilcolinesterasa aumentan paralelamente durante el desarrollo (Mobley y cols., 1988). Los niveles más altos de PrPC se encuentran en cerebro, particularmente en el hipocampo, existiendo niveles significativos en corazón y músculo esquelético y, más bajos en la mayoría de los órganos restantes excepto en hígado y en páncreas (Prusiner ,1997).
La proteína celular del prion
El producto traducido a partir del mRNA es una cadena polipeptídica de alrededor de 250 aminoácidos, dependiendo de la especie, en la que se distinguen una secuencia señal N-terminal de 22 residuos, una serie de repeticiones de un octapéptido PHGGGWGQ, cuatro segmentos áltamente conservados en las posiciones 109-122, 129-140, 178-191 y 202-218, una región hidrofóbica C-terminal (Schätzl y cols., 1994; Prusiner, 1997). Esta cadena sufre un proceso de maduración covalente complejo que supone: la escisíón proteolítica de los péptidos señal, la adición C-terminal de un glicanfosfatidilinositol (GPI), la formación de un enlace disulfuro intramolecular y, por último, una doble glicosilación en los residuos de Asn 181 y 197 (Prusiner, 1991).
PrPC es una proteína capaz de unir específicamente Cu2+, para la cual se postula un papel activo en la homeostasis de este catión implicado en procesos de oxido-reducción (Brown y cols., 1997; Stöckel y cols, 1998). La estructura secundaria de PrPC, solubilizada en detergentes y en ausencia de cationes, es mayoritariamente helicoidal mientras que la formación del complejo conlleva un aumento del contenido en estructuras extendidas (Pan y cols., 1993; Stöckel y cols., 1998). Estudios espectroscópicos de alta resolución con formas recombinantes en ausencia de ligando han puesto de manifiesto que PrP está constituída por dos dominios, el N-terminal áltamente desestructurado y el C-terminal globular (Donne y cols., 1997; Riek y cols., 1997).
Con respecto al metabolismo celular de PrPC, estudios de translocación in vitro han identificado tres formas topológicas de PrP: una forma de secreción (coincidente con la anclada por GPI) y dos formas transmembranas que difieren en su orientación (el N-terminal luminal y el C-terminal luminal) (Hedge y cols., 1998). La forma de secreción es transportada en vesículas de secreción a la superficie exterior celular donde queda anclada a través del GPI en dominios particulares (Stahl y cols., 1987; Taraboulos y cols., 1992). Una vez allí, algunas moléculas son liberadas al espacio extracelular por escisión del GPI mientras que la mayoría es internalizada en el compartimento endocítico (Shying y cols., 1993). Estas últimas bien son recicladas hacia la superficie celular o bien sufren una ruptura proteolítica en la mitad del N-terminal cuyos productos son expulsados al exterior celular (Shying y cols., 1993). El metabolismo de las formas trasmembrana no se conoce con exactitud, pero la acumulación por encima de un umbral de las formas con el C-terminal luminal se correlaciona con la aparición estados neuropatológicos (Hedge y cols., 1998).
Las formas patológicas de la proteína del prion.
En las patologías de priones PrPC se transforma post-traduccionalmente en una isoforma generalmente denominada PrPSc (Prusiner 1991, 1997). Esta conversión, que tiene lugar en dominios de tipo caveola, se caracteriza por un cambio drástico en las propiedades físicas y químicas de la molécula (Caughey y Raymond, 1991; Taraboulos y cols., 1992; Prusiner, 1997). PrPC es soluble en detergentes mientras PrPSc forma unos agregados amorfos insolubles. PrPC se libera de la membrana en forma soluble por digestión con PIPLC, mientras que PrPSc no es susceptible a la acción enzimática requiriendo un tratamiento desnaturalizante previo para la eliminación del GPI. PrPC es sensible a la acción de proteasas y PrPSc, por el contrario, sufre una proteolisis limitada generando la forma truncada en el extremo N-terminal que agrega en forma de amiloides y retiene la infectividad. (Prusiner, 1991; Ghetti y cols., 1996). No obstante, existen estados patológicos en los que no ha podido detectarse PrPSc en términos de resistencia a proteasas pero la descripción reciente de formas transmembrana podría estar implicada en estos casos (Hedge y cols., 1998).
Las modificaciones post-traduccionales de carácter covalente no parecen ser la causa directa del proceso de conversión pero sí de su modulación. De esta forma, el GPI determina la posibilidad de conversión ya que ésta ocurre en dominios especializados de membranas donde se confinan las proteínas ancladas por GPI (Taraboulos y cols., 1995). Por otra parte, la glicosilación va a determinar el tráfico intracelular de la proteína (DeArmond y cols., 1997)
Los estudios espectroscópicos han permitido establecer que la estructura secundaria de PrPSc dispersada en detergentes, a diferencia de la de PrPC, presenta como elemento mayoritario la cadena b estabilizada en láminas y que el comportamiento amiloídico está vinculado a la presencia de láminas b intermoleculares (Caughey y cols., 1991; Pan y cols., 1993). Esta dualidad conformacional hélice a-lámina b parece localizarse principalmente en la regiión 106-126, que en forma de péptido sintético es un neurotóxico potente (Gasset y cols., 1992; Forloni y cols., 1993).
La replicación de los priones o la propagación de una conformación.
El mecanismo mediante el cual se propagan los priones no se conoce con precisión. Aunque algunos investigadores siguen postulando la necesidad de un ácido nucleico específico de priones, no existen evidencias físicas ni químicas de su existencia. En el caso de existir, cabe esperar que dicha molécula dirija la replicación de priones empleando una estrategia similar a la de los virus.
La multiplicación de la infectividad de priones es un proceso exponencial que implica obligatoriamente la conversión post-traduccional de PrPC o de un precursor en un confórmero distinto, PrPSc. El nivel de expresión de PrPC es directamente proporcional a la velocidad de formación de PrPSc y, por tanto, inversamente proporcional a la longitud del tiempo de incubación. El proceso de propagación de un prion se inicia con la interacción de la PrPSc exógena con PrPC o con una forma parcialmente desnaturalizada de ésta, PrP* (Scott y cols., 1989; Kocisko y cols., 1994). El reconocimiento de PrPSc ocurre a través de la región 96-167, siendo necesaria pero insuficiente la identidad de secuencia (Scott y cols., 1993; Büeler y cols., 1993; Telling y cols., 1995). Por otra parte, mutaciones puntuales y variaciones en la longitud de la cadena polipeptídica de PrPC así como alteraciones metábolicas pueden desembocar en situaciones patológicas (Hsiao y cols., 1989; Westaway y cols., 1994; Prusiner, 1997).
Con estas premisas experimentales se han elaborado dos modelos en los cuales se traduce la infectividad en términos de una proceso de autopropagación de la conformación de PrPSc que incluye una etapa controlada cinéticamente. El "modelo de desnaturalización-renaturalización catalizada" (Prusiner y cols., 1996) asume que el cambio conformacional es la etapa limitante del proceso ya que supone una desnaturalización y renaturalización de la cadena polipeptídica y lo asemeja a una reacción catalizada enzimáticamente: 1) PrPC es el sustrato y PrPSc el producto de la reacción; 2) la velocidad de la reacción, manifestación inversa del tiempo de incubación, depende de la concentración de sustrato; 3) PrPSc es un efector alostérico que regula la conversión de PrPC en PrPSc; 4) un análogo de sustrato, como una molécula de PrPC de distinta especie, puede retrasar la conversión actuando como inhibidor competitivo. El "modelo de polimerización nucleada por condensación no covalente" (Kocisko y cols., 1995) supone que el cambio conformacional está ligado a un equilibrio de asociación, de manera que ambas conformaciones existen en equilibrio pero la estabilización de la isoforma patológica ocurre a través de la formación de un núcleo que constituye la etapa lenta del proceso. Una vez constituído el núcleo, éste crece por adiciones sucesivas y rápidas de nuevas moléculas disparándose el proceso. Ambos modelos justifican las tres variantes patológicas. Las patologías infecciosas serían el resultado de la presencia exógena de PrPSc, es decir del catalizador o efector o del núcleo. Las patologías hereditarias ocurrirían por una desestabilización de la estructura de PrPC o una estabilización de la estructura de PrPSc favoreciendo la población del estado patológico. Por último, las enfermedades esporádicas, aunque de etiología desconocida, podrían surgir por alteraciones metabólicas o bien mutaciones espontáneas que conlleven la formación de PrPSc. Ambos fenómenos aún ocurriendo en una única célula podrían desencadenar la formación de PrPSc y su autopropagación, que se extendería por el sistema nervioso central.
La barrera de especie o las imposiciones del reconocimiento molecular.
La transmisión de priones entre distintas especies es un proceso estocástico (Pattison, 1966). En el caso de ocurrir, este proceso es muy poco eficaz y sucede con una prolongación del tiempo de incubación que tras pases subsiguientes, o adaptación, se acorta y estabiliza y la transmisión deja de ser un proceso probabilístico. Los priones sintetizados de novo reflejan la secuencia del gen de la PrP del huesped (PrP endógena). Los estudios pioneros de Scott y cols. (1989) pusieron de manifiesto que la barrera de especie era la manifestación de las restricciones de secuencia de un proceso de reconocimiento molecular. Así, la infección ocurre a través de un complejo PrPC-PrPSc, cuya formación está gobernada por el grado de identidad de secuencia entre la proteína endógena y la exógena (Scott y cols., 1989; 1993). La identidad en el segmento 96-167 es necesaria pero insuficiente (Scott y cols., 1993; McKenzie y Marsh, 1996; Telling y cols.,1995). postulándose la existencia de un factor adicional o proteína X implicado en el reconocimiento de la región C-terminal (215-230) de PrPC. Así, al igual que la interacción de PrPC con PrPSc es más eficaz cuanto mayor es la identidad de secuencia en la región 96-167, la interaccion de PrPC con la proteína X es máxima cuando ambas son de la misma especie. Esta proteína X podría ser PrPSc si esta última hiciese las veces de ligando bidentado (Telling y cols., 1995).
La variabilidad de inóculos o el resultado de una multiplicidad conformacional.
Uno de los aspectos más llamativos del campo de los priones en su multiplicidad. Este fenómeno fue descrito en 1968 por Dickinson y cols., quienes aislaron distintos tipos o inóculos de priones de scrapie de oveja. Estos inóculos, se diferenciaban en los tiempos de incubación y en el patrón de la lesión del SNC causada en lineas establecidas de animales de experimentación (Dickinson y cols., 1968; Bruce y Fraser, 1991; Hecker y cols., 1992; DeArmond y cols., 1993). Las proteínas aisladas de cada inóculo son indistinguibles con respecto a la estructura primaria pero difieren en el grado de glicosilación y en el tamaño del producto de proteolisis limitada, es decir en la conformación, (Collinge y cols., 1996; McKenzie y cols., 1996; Telling y cols., 1996). Estas diferencias son transmisibles a PrPC por interacción directa en condiciones de desnaturalización parcial e in vivo,y por lo tanto, difícilmente pueden justificarse en términos de una modificación covalente diferencial (Bessen y cols., 1995). Así, la existencia de inóculos parece en una multiplicidad conformacional, bien en la estructura secundaria o bien en las de orden superior.
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